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前段时间，俄罗斯科学家在一个小东西身上搞出了个“大新闻”——他们复活了一批在西伯利亚冻土层中休眠了46000年的线虫！
这个新闻让我想到了一种在科幻电影中常被用于帮助主角跨越漫长岁月，但在现实里依旧困难重重的技术——冷冻休眠。
当科幻照进现实，很多人不禁会问：线虫已经成了，人类还会远吗？
要回答这个问题，还是得先理解这些科学家到底干了什么。
七月底（27日），生物-遗传学领域的学术期刊《PLoS Genetics》上发表了一篇名为《来自西伯利亚永冻土中的一种新型线虫与秀丽隐杆线虫的Dauer幼虫具有相似的隐生适应机制》的论文。
这种新线虫被命名为Panagrolaimus kolymaensis（P型线虫），是研究人员在北极东北部沿海地区的晚更新世永冻土中（地表以下约40 米）采集的。
通过放射性碳-14测年法，科学家发现这类P型线虫自更新世晚期（约46000年前）以来，一直处于隐生状态。
01
线虫隐生复活
所谓隐生，指的是当环境不利于生存时，例如缺水、缺氧、高温、冰冻或极端盐度，生物体会暂停代谢，进入“假死”。
科学家曾在一块琥珀里的蜜蜂腹部发现了颗保存了4000万年的芽孢杆菌孢子，以及在一个远古湖泊中发现的具有1000到1500年历史的莲花种子（后来发芽了）。
而在地球上最干燥的沙漠之一，智利的阿塔卡马沙漠中，研究人员采集了一种脱水干燥了近40年的线虫，并成功将其复活！
以上这些都是生物体隐生的典型案例。
从极端干旱到极端寒冷，研究人员这次从永冻土（常年冻结的沉积物）内采集到的P型线虫，不仅更古老，而且在把它们解冻约10天后，观察到它们成功开始了无性繁殖。
“重生”能力属实过于强悍了！
为了搞清楚这类线虫是如何“穿越时间”的，科学家对它和它的近亲秀丽隐杆线虫（C.elegans）进行了实验研究。
研究的过程，便是让它们重现隐生时的状态——脱水和冷冻。
目前已经知道的是，在秀丽隐杆线虫的发育过程中，当遇到不利条件（例如低营养和高密度）时会进入一种低代谢的状态。此时它们的耗氧量和散热量急剧减少，被称为Dauer幼虫阶段。
研究人员将Dauer幼虫在98%的相对湿度（RH）下预处理了4天。由于这些被处理的线虫一直在培养液中生长繁殖，所以对它们来说，即便是98%的高湿度的环境，也属于轻度的干燥。
在此过程中，幼虫通过激活乙醛酸循环和糖异生过程来消耗脂肪储备（三酰甘酯TG），并加速合成了海藻糖。
海藻糖（分子式为CHO）具有提高细胞膜对干燥环境的耐受性（保湿）的作用。
之后，为了调查Dauer幼虫是否也可以在隐生状态下长期存活，研究人员对它们做了进一步干燥。
不过，这些干燥的幼虫在室温下的生存能力下降得非常快，大多数幼虫在近10天后死亡。但当把它们转移到零下80℃的环境里后，即便过了480天，它们的活力也没有明显下降，并在解冻后恢复了生长并成功繁殖出了后代。
这表明脱水和冷冻相结合可以延长Dauer幼虫的存活能力。
与秀丽隐杆线虫不同的是，P型线虫没有Dauer阶段。因此，研究人员对它们的幼虫和成虫都进行了实验。
在同样的预处理后，发现P型线虫体内的三酰甘酯水平也出现了明显降低，并生成了更多的海藻糖。
在之后的深度干燥和冷冻过程中，研究人员发现，一些P型线虫具有快速干燥及耐冻的适应性机制，它们会丧失体内大部分细胞的水分，有水分的区域也不会因冷冻而产生致命的冰晶。
从左到右，冰晶越来越难以形成
这才是最有意思的地方——它们体内的某些组织具有抑制冰晶生长的能力，而后者，才是阻碍体型更大的动物，甚至是人类实现冷冻休眠的最大障碍。
02
生物冷冻技术
早在上世纪五、六十年代，科学家就进行了生物冷冻保存技术的研究。例如观察冷冻对啮齿动物大脑及其他器官的影响。
当然结果显而易见，损伤总是会发生。
生物组织在被冷冻的过程中，主要会发生三个层次的变化，一是细胞内部结冰。
二是如果冷冻速度不够快，水会从细胞内渗出，在细胞外形成外冰。
最后则是水的迁移所导致的脱水及渗透压的变化。
细胞周围一旦有了冰，那便是致命的威胁。因为从微观角度看，冷冻将水分从紧密堆积的无定形流体转变为刚性的晶体，这些满是棱角的冰晶就会像刀子一样撕裂细胞，或是对对细胞膜造成机械损伤。
同时，细胞液中的各种盐分也会在冻结的组织中浓缩至有毒的浓度。
避免结冰，也就成了冷冻保“活”技术的首要目标。
上世纪六十年代期间，美国的研究人员发现，如果冷冻的速度足够慢，慢到使充足的水分离开细胞，就可以避免细胞内部结冰。而这也促成了慢速控制冷冻技术（SPF）的出现。
右上图是缓慢冷冻细胞，有外冰，无内冰；右下图是快速冷冻产生内冰
SPF是一种将细胞在几个小时内冷却至零下196℃（液氮沸点）的技术。除了缓慢冷冻这个要点，该技术还需要加入防止细胞在冷冻过程中受损的冷冻保护剂。
常用的冷冻保护剂多是一些小分子物质，可以透过细胞膜渗透到细胞内。包括二甲基亚砜、甘油、乙二醇、丙二醇和甲醇等。
加入冷冻保护剂可最大限度地避免内外冰的形成
这类保护剂能够在细胞液凝固之前，穿过细胞膜渗透到细胞内，降低细胞内外未结冰溶液中的电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤。
同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。
此外，将以上小分子保护剂与藻酸盐、聚乙烯醇或葡聚糖等生物大分子保护剂（不会渗透进细胞内）结合，可阻止细胞外的冰晶生长。
后者的作用机制是大分子物质可以优先同溶液中的水分子氢键结合，从而降低溶液中自由水的含量，减少冰晶的形成。
有了冷冻保护剂的协助，便可利用SPF来冷动细胞或组织。不过，需要注意的是，对于不同大小和透水性的细胞，理想的冷却速率也不同。
例如，用甘油等冷冻保护剂处理后的哺乳动物细胞，最合适的冷却速率是约-1℃/分钟。
SPF诞生于20世纪70年代初，并在80年代被用于人体胚胎冷冻。
1984年4月11日，人类第一个“冷冻婴儿”诞生于澳大利亚，是一名叫Zoe的女孩。
从那时起，利用该技术来冷冻卵母细胞、胚胎、精子、干细胞等人类或动物组织就成为了研究机构或医院的常用操作。
然而，刻在SPF骨子里的“慢”算不得是个优点。因此，在上世纪80年代中期，美国的研究人员在卵细胞的冷冻保存研究中又开创了一种新的方法——玻璃化冷冻。
相比于SPF，玻璃化冷冻最显著的特点是“快”：将常温细胞在几分钟内冷冻到零下196℃。
其原理在于通过快速冷冻，使组织内的液体来不及形成结晶，水分子凝聚为团块，形成一种坚硬、圆润、玻璃状的固体。由于没有“棱角”，也就不会产生对细胞产生伤害。
这种相变过程类似于糖水凝为糖浆，而不是结成冰糖。
为了实现玻璃化冷冻，通常需要添加冷冻保护剂来使液体的粘度增加和冰点降低。也正因如此的需求，相比于SPF，该技术需要更高浓度的保护剂。
当置于高浓度保护剂中的细胞的细胞液与保护剂达到动态平衡后，细胞体积会因脱水而缩减30-50%。之后，将其置入液氮中使其瞬间玻璃化。
无冰晶形成，便避免了细胞受损。
如今，玻璃化冷冻和SPF一道，被广泛应用于医疗或科研领域。但遗憾的是，它们更适用于保存单个细胞、胚胎，或薄的组织样品。
原因在于，一方面，小而薄的东西当然能被更快、更均匀地冷却，大的器官或组织则会由于不同部位的冷却速度不一致而增加冰晶产生的风险。
另一方面，越大的组织也就需要越多的冷冻保护剂，而后者并不是一种无害的东西。
以常见的冷冻保护剂二甲基亚砜（DMSO）为例，当用于细胞冷冻的DMSO浓度为10 %时，细胞生长抑制率近100 %；1%浓度时抑制率为35%，即使是0.04 %的浓度，DMSO对细胞的生长也有不利的影响。
因此，虽然冷冻的目的就是为了使细胞“假死”，但保护剂的副作用却必须要被认真对待。
目前解决该问题的思路主要有以下几种：组合使用不同的冷冻保护剂来减少单品药剂的毒性作用；使用具有弱水相互作用的冷冻保护剂来减少对生物分子周围的水化层的破坏；以及使用毒性会相互中和的冷冻保护剂等。
当然，相关研究目前还在进行中。
最后，从冷冻状态恢复到正常温度也是个风险极大的过程。
对于小微组织来说，在室温或冰水中放置就能很快实现升温。但对于整个器官或大组织来说，却很难完成得快速又均匀。
想象一下，将冰箱里冷冻的一块肉放到水里解冻，可能它的外层在五分钟后就化开了，但内部在半小时后还满是冰碴。
以上问题的存在，也是为什么冷冻卵子或精子已经算不上是个新闻，但与医疗救助更紧密的项目，例如冷冻保存人类肝脏或心脏以进行储存和移植仍然任重而道远。
03
冷冻器官复温
2002年，美国的研究人员首次对兔子的器官进行了冷冻移植实验。他们先是将兔子肾脏进行玻璃化冷冻，升温后又将起植入了另一只兔子体内。
这只兔子在器官移植后又活了近7周，但尸检结果显示，尽管那颗移植的肾脏足以维持生命，但其大部分功能已经受损。
后来的分析表明，这个肾脏的损伤主要发生在升温过程。
2023年6月，《自然通讯》杂志上刊登了一篇名为《通过玻璃化冷冻及纳米加热在老鼠身上实现长期的肾脏保存和移植》的学术论文。作者是美国明尼苏达大学的研究人员。
自2018 年以来，这些研究人员成功冷冻并复活了珊瑚、果蝇幼虫，以及斑马鱼胚胎。而在这篇最新的成果中，他们首次成功移植了玻璃化冷冻100天后，又经过氧化铁纳米颗粒加热复原的老鼠肾脏。
在这项实验中，研究人员将一种名为VMP的冷冻保护剂通过动脉血管注入老鼠肾脏中，由于保护剂中掺入了氧化铁纳米颗粒（IONP），因此呈现黑色，并导致肾脏从深红色转成了乌色。
之后，他们将该肾脏放入了零下150℃的冰箱中长达一百天。
一百天后，研究人员将硬邦邦的肾脏放置在射频线圈中进行加热，这种加热方法的原理是通过射频电流产生快速变化的磁场（每秒翻转南北极36万次），来在IONP中产生涡流，从而起到加热作用。
这种由内到外的高效加热方式，在90秒内完全解冻了肾脏。
之后，研究人员往肾脏中灌入了冲洗液，来将保护剂和IONP冲洗出去。
冲洗干净的肾脏被接入小鼠体内并恢复血液流通后，很快就恢复了原本的深红色。从外表以及组织切片看来（下图最右），与新鲜的对照器官十分接近。
（从左到右分别是新鲜肾脏、冷冻60小时后移植的肾脏（失败）、新鲜移植的肾脏、纳米加热后移植的肾脏）
45分钟后，研究人员从输尿管中看到了象征实验成功的金色尿液——肾脏开始工作啦！而且，在后续的跟踪观察中，没有发现任何副作用，例如血栓的形成。接受肾脏移植的小白鼠也还在正常生活着。
这是人类首次实现对整个器官的长时间冷冻再加热移植。虽然实验对象只是小白鼠，但却让研究人员受到了极大的鼓励。
不出意外的话，这条玻璃化冷冻整个器官再进行纳米粒子加热复温的技术路线应该是走通了。于是，研究人员迅速将目标转向了猪肾脏，后者更接近人类肾脏的大小。
你是不是会以为事情会一帆风顺地发展下去？事实上，艰难坎坷、道阻且长才是科研的常态。
该研究的负责人没有谈论新研究的细节，而是说了一句话：“没有任何原因能让我们解释为什么这种加热方式在较大的器官中不起作用。”
果然，器官越大，问题越多，难度越大。总是会有一些不明就里的原因阻碍着科研取得突破。
04
人体冷冻技术
生物冷冻技术早已不是新鲜出炉的黑科技。它也被早早地应用在了医疗、科研、商业领域。
从上世纪80年代世界首例“冷冻儿”诞生至今，已有50万左右的 “冷冻宝宝”诞生。经过近40年的发展，冷冻胚胎已经成为了一项相当成熟的技术。
此外，根据国内外的后续随访，人们发现从解冻、复苏、移植后的冷冻胚胎中生出的孩子与自然妊娠分娩的孩子并无明显差异，更未见任何劣势。
但这还不能完全满足人类的切身需求，以及“野心”。
无论是不复困难的细胞、胚胎冷冻，还是依然任重道远的整体器官冷冻，最终都是为了那个依然虚无缥缈的目标积累经验，那便是人体冷冻。
由于实行人体冷冻需要将全部血液抽出并注入冷冻保护剂，因此，从伦理角度考虑，以及在当前的学界研究和实际应用中，人体冷冻技术的处理对象还只是人类遗体。
那些决定去冷冻的人或他们的家人抱着一个希望，期待科技更为发达的若干年后，能将因病致死或自然衰亡的人重新解冻、复活。
第一具被冷冻保存的遗体出现在1967年12月。他是一名因肾癌引发的心脏骤停而死亡的美国人，名叫James Bedford，是加利福尼亚大学的美国心理学教授。
不过，由于初期的处理不及时，没有准备好冷冻储存罐，致使他的大脑由于温度升高而遭到破坏。
如今，Bedford的遗体依然保存在美国的Alcor生命延长基金会（Alcor Life Extension Foundation），但或许更多的是一种象征意义吧。
截止到2022年，全球大概已有500具自然死亡的遗体被进行了冷冻处理，更有数千人报名预约了该项服务。而在这其中，就包括了十余名中国人。
2015年，科幻小说《三体》的编审之一杜虹女士因胰腺癌晚期步入了生命的最后阶段。或许是小说中的前沿技术与人物（云天明）命运给她提供了些许启示。
在临终前，杜虹委托Alcor基金会冷冻保存自己的头部，期待未来的重生。
2017年，一名因癌症去世的女子成为了中国首例在本土冷冻的志愿者，她的遗体目前就在山东银丰生命科学研究院中。
目前，全世界有4家机构能提供人体冷冻服务，它们分别是美国的Alcor、人体冷冻研究所（Cryonics Institute），俄罗斯的KrioRus，以及中国的山东银丰生命科学研究院。
不过，且不论这些已逝或未逝的人的期盼——由死而生——多久能实现，因为这可能需要人类完全攻克癌症、心脏病等医学难题，甚至做到逆转衰老。
单是将完全冷冻的人体安全地解冻，都还是一个未能实现的技术！
可别忘了，人类从上世纪五十年代开始研究冷冻啮齿动物，直到约七十年后的今年才初步完成了对老鼠肾脏的冷冻移植。
在将冷冻再复温技术成功应用到猪身上之前，人就别想啦！这不是调侃，而是事实！
因此，在这条可预见的艰难又漫长的科研之路上，科学家不仅要投身于实验室，还要多向自然界的生物中学习取经。
这也是为什么我们开头提到的冷冻4.6万年后又复活的线虫如此引得学界关注的原因。
4.6万年啊！可是大大地刷新了动物经受最长冷冻时间的纪录。
在这些线虫刚进入休眠之时，地球上还是新生代第四冰河期。它们或许正与人类的祖先之一——尼安德特人为邻，而后者当时正统治着欧洲和亚洲西部。
除了这些能力逆天的线虫，自然界中还有其他动物具有冷冻后再复活的能力。
2015年，日本国家极地研究所的研究人员将在南极洲昭和站的苔藓植物中发现的冷冻30多年的缓步动物——水熊虫——成功复活，之后还产了仔！
实际上，被誉为地球最强生物的水熊虫不仅能度过冷冻，还不怕水煮、风干，甚至能在真空或放射性环境下存活！
如果说线虫或水熊虫过于微小，以至于对人体冷冻研究的借鉴意义有限的话，那接下来的这种动物则宏观可见，那就是北美地区的一种林蛙。
为了度过当地的寒冬（能达到零下16℃以下），这种棕色的林蛙不能只靠像普通的青蛙那样躲在水底或洞穴里冬眠的方式，还得发挥出自身的黑科技——蛙体冷冻。
当准备过冬时，它们的身体会产生糖醇甘油并融入血液中，作为天然的冷冻保护剂。
同时，血液中的某种特殊蛋白质会充当冰晶核，其作用是引导冰在更结实的脉管系统中（由心血管系和淋巴系组成的一系列密闭的分布于全身的管道系统），而不是在其他相对更脆弱的组织中生长。
此外，林蛙还会分解骨骼肌的蛋白质和脂肪体的脂肪，将其转化为肝糖原，储存在肝内，然后将肝糖原转化为葡萄糖或形成尿素传输至身体各处。
葡萄糖和尿素的作用是提高组织内的体液浓度，降低冰点（同样也是起到了冷冻保护剂的作用）。
当进入冰冻时节，只要林蛙身体被冻结的水分不超过65%，它就能安全地进入一种类似于线虫隐生的几乎停止代谢的状态，其心脏跳动和呼吸也会停止。
冷冻休眠的林蛙能休眠10天左右，忍受比正常时期高100倍的血糖水平。
随着天气变暖，它们也能自然解冻并恢复活动。但一般来说，冷冻时间越长的青蛙，生命功能（血管循环、肺呼吸、翻正反射、跳跃反射）恢复也越晚。
从以上内容可以看出，林蛙可不仅是个做食物、药材（雪蛤）的宝，更是科研人员的宝贵研究对象。
虽然它身上还有不少秘密有待理清，但已经有科学家通过模仿它们的身体机能来推进人体器官冷冻研究。
2019年，研究人员向人类肝脏中注入一种包含海藻糖及甘油的冷冻防护剂后，成功将肝脏在–4℃下保存了27小时。而这是用于医疗移植的肝脏，在不产生损伤的前提下，所能接受的最长冷冻时间（约12个小时）的两倍多。
前段时间，研究人员又将这种存在于线虫和林蛙的冷冻体中的物质与Snomax（一种用作造雪雪种的材料，其作用与林蛙血液中的蛋白质一样，可以减缓冰的形成）混合，注入了大鼠肝脏的血管中。
在把肝脏放置在零下15℃的环境下冷冻5天再次解冻后发现，相比于以往的实验，肝脏受到冷冻损害的程度明显降低……
05
尾声
在很多科幻电影中，例如《2001太空漫游》（1968）、《异形》（1979）、《美国队长》（2011）、《星际穿越》（2014）等，都能看到主角冷冻后很多年再被唤醒（复活）的情节。
人们当然期待这类故事能成为现实，但电影里一句话或一个场景带过的技术，在现实生活中却需要几十上百年的努力，而且还不确定何时能完成。
长时间的冷冻保存（及升温复活）是一项跨学科的技术，涉及医学、生物学、化学和物理学等多个领域。
目前来看，无论将该技术应用于整个人体还是组织器官，依然困难重重。但一旦它取得突破，发展成熟，将必然会造福大众！
毕竟，即便大多数人并不曾奢望永生，或跨越时间进入未来，但医疗用途，特别是器官移植的迫切需求，仍需该技术达到一个更高的水平。
从上世纪五十年代算起，冷冻保存技术已经发展了七十余年。
但如果我们回头再看的话，这与大自然赋予那些线虫身上的能力相比，还是稚嫩了些！
可话又说回来，人类就是因为意识到自身的脆弱与局限，才会热衷于追求这些有可能让我们突破局限的技术。
目前，科学家还不清楚那些隐生了4.6万年的线虫体内具体发生了哪些分子和生化过程，更好奇它们最长可以“暂停”生命多长时间。
我们期待能探清自然的极限到底在哪里，相关研究也会一直进行下去。
参考文献：
[1]A novel nematode species from the Siberian permafrost shares adaptive mechanisms for cryptobiotic survival with C. elegans dauer larva, https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1010798#pgen.1010798.s004
[2]FROZEN IN TIME, https://www.science.org/content/article/how-to-deep-freeze-entire-organ-bring-it-back-to-life
[3]Anhydrobiosis and Freezing-Tolerance: Adaptations That Facilitate the Establishment of Panagrolaimus Nematodes in Polar Habitats, https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0116084
[4]Biopreservation and cold chain biologistics risk points in the cell and gene therapy workflow, https://insights.bio/cell-and-gene-therapy-insights/journal/article/1805/Biopreservation-and-cold-chain-biologistics-risk-points-in-the-cell-and-gene-therapy-workflow
[5]海星带您一起解析细胞冻存，DMSO,
https://baijiahao.baidu.com/s?id=1713022242644847487&wfr=spider&for=pc
[6]冷冻三十年，水熊虫成功复苏,
https://www.cas.cn/kj/201601/t20160121_4521703.shtml
[7]Cryonic Institute Technology for Life, https://cryonics.org/
[8]银丰生物集团,
http://www.yfswjt.com/touzi_info.php?id=69orderby3
[9]Freeze duration influences postfreeze survival in the frog Rana sylvatica, https://www.researchgate.net/publication/297910690_Freeze_duration_influences_postfreeze_survival_in_the_frog_Rana_sylvatica
[10]“超级冷却”技术或使肝脏体外保存时间大大延长,
https://news.medlive.cn/liver/info-progress/show-161685_35.html
来源：https://view.inews.qq.com/k/20230823A027D600
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